关且具有致命性的肺部疾病，每年可导致数百万人死亡，中位生存期2.5-3.5年。长期

  以来，IPF一直被认为是由炎症引起的，但目前的研究证据说明，纤维化反应主要由肺

  分泌大量的促纤维化生长因子和细胞因子，引起间充质细胞发生迁移、增殖和活化，

  又可作用于成纤维细胞，诱导其向肌成纤维细胞分化，促使细胞外基质（extracellular

  的主要成分，主要来自于磷脂酶A2对磷脂的切割，也可由内皮脂肪酶和肝脂肪酶对

  HDL-PC的裂解产生不饱和脂肪酸。不同来源和结构的lysoPC可能具有不一样的生物学

  效应，在疾病中发挥着不同的功能。因此，我们将对lysoPC14:0在肺纤维化发生过程

  为探究lysoPC14:0在肺纤维化中的作用，对IPF患者的血清样本做分析发现，

  lysoPC14:0和16:0表达丰度在IPF患者血清学样本中非常明显升高。此外，对博来霉素损伤

  后的A549细胞取其培养基进行高效液相质谱分析，相比于对照组，lysoPC16:0和14:0

  在博来霉素损伤的A549培养基中表达丰度非常明显升高。所以，推测IPF患者肺泡上皮细

  胞受损后分泌的lysoPC增多。多项研究报道，lysoPC16:0可促进肺部炎症的发生，但

  lysoPC14:0在肺部相关疾病中的作用尚未完全阐明。因此，在体外，使用lysoPC14:0处

  光和细胞凝胶收缩等实验方法来探究其对成纤维细胞的作用，实验根据结果得出lysoPC可

  促进肺成纤维细胞的增殖活化。为进一步阐明lysoPC对成纤维细胞的活化作用，小鼠

  肺内灌注lysoPC，发现其肺部组织损伤严重，羟脯氨酸含量非常明显升高。进一步探究发

  现lysoPC介导其成纤维细胞活化的机制是通过激活ROS激活了TGF-β/SMAD信号通

  综上所述，IPF患者血清中lysoPC表达丰度升高，可能是由于肺泡上皮细胞损伤后

  的分泌增加，从而促进肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，加重肺纤维化的发生发展，

  并且我们得知这种活化机制是通过ROS/TGF-β/SMAD信号通路起作用。本文不仅验证

  了lysoPC14:0对成纤维细胞的影响，更进一步强调了脂质代谢在IPF发病机制中的作

  关键词：肺纤维化，溶血磷脂酰胆碱14:0，成纤维细胞，ROS，TGF-β/SMAD

  4.3.1LysoPC14:0促进成纤维细胞的活化可能是通过激活TGF-β信号通路45

  4.3.4LysoPC促进TGF-β信号激活依赖其向线细胞和成纤维细胞的共培养49

  组织纤维化的发生，在短期内，机体可能会适应这种纤维化反应，但跟着时间的积

  累，这种反应会使组织出现实质性的瘢痕，致使细胞功能障碍和器官衰竭。世界上大

  多数工业化国家，由纤维化疾病引起的死亡率可高达45%。长久以来，人们认为纤维

  化的发生是一个持续不断且不可逆转的过程。多项实验研究表明，纤维化不是一种疾

  病，而是组织异常修复的结果，是一种高度动态化的过程。当器官受损时，局部组织

  成纤维细胞激活且收缩能力增强，炎症细胞浸润性增强，导致细胞外基质成分增加，

  共同启动伤口愈合反应。当损伤是轻微的或是非重复性的，暂时性积累的ECM成分会

  被机体清除，促使正常的细胞组织架构进行修复。然而，当损伤是严重的或是重复性

  的，ECM将出现持续性的累积，这可能会导致组织结构的破坏，瘢痕化发生，组织或

  者器官产生纤维化。遗传、衰老、细菌或病毒性感染以及慢性炎症反应都会影响纤维

  化的发生和最终的修复。目前，这种疾病的发病机理尚未阐明，在临床上也缺乏有效

  炎症和肺间质进行性纤维化，高分辨率胸部计算机断层扫描成像是目前ILDs常用的诊

  断工具，但仅可在典型的瘢痕组织形成时才可确诊纤维化的发生，因此，在临床上常

  引起诊断的延误。手术肺活检的组织病理学检查是目前临床上鉴别ILDs的金标准，

  但是由于手术的成本过高，复杂性较强，风险性较大，在临床上的应用也受到限制。

  同时，各类临床疾病在发病进程中都有可能导致肺纤维化的发生，比如类风湿性关节

  炎、硬皮病等引起的继发性肺纤维化，这作为肺纤维化的一种致病因素，使该病在预

  防和治疗上也加大了难度。肺纤维化主要影响机体的呼吸功能，患病者主要表现为干

  咳，呼吸困难，随着病情逐步发展，肺部出现不可逆转的损伤，患者最后可因呼吸衰

  在特发性间质性肺炎中，IPF是最常见以及最恐怖的一种类型。IPF是一种发病机

  制未明，慢性，进展性，不可逆，通常具有致命性的慢性肺部疾病，发病率具有年龄

  依赖性，一般患病率年龄在55岁以上，男性多发于女性，其中位生存期2.5-3.5年。大

  多数患者肺功能为缓慢进行性下降，而10%-15%的患者在几个月内肺功能出现快速异

  常下降。虽然IPF是ILDs最常见的类型，但是这种疾病依然被认为是罕见的，其发病

  机率于胃癌、脑癌和睾丸癌相似，不过，随着人口的老龄化的不断加重，IPF的发病率

  在世界范围内不断增加，与此同时，IPF患者肺癌的发生率也在不断增加。北美和欧洲

  人群的流行病学研究表明，每年每10万人中有3-9例病例，并且总体发病率也在不断

  增长。美国最近一项针对65岁以上医疗保险受益人的研究表明，从2001年到2011

  年，IPF的患病率从每10万人中202例增加到495例。IPF最突出的且不可改变的危险

  因素是性别和年龄，英国的一项研究表明，85%的患者首次诊断为IPF时年龄超过70

  岁，且男性多发于女性，这可能是由于吸烟等外界因素所引起的，但目前还没有完全

  的定论。IPF与典型的间质性肺炎的放射学和组织学模式相关，UIP通常表现为“蜂窝

  型”，胸膜下及胸膜旁纤维化牵拉性支气管扩张，周围肺泡间隔增厚。IPF则认为是从

  肺的基部和边缘开始，从外向内逐渐发展到整个肺部组织，这种疾病一般表现为散发

  性或者家族性，但具体的发病原因尚不清楚[10,11]。IPF患者的预后较差，一些相关研究

  表明，IPF患者的生存率甚至比癌症患者还低，且目前无较为有效的治疗方式。但美国

  的一项研究显示，由于吸烟流行率下降、免疫抑制剂使用减少以及新治疗方案的引

  入，从2004年到2017年，IPF总生存率在不断提高。这些数据表明在使用抗纤维化药

  对疾病的疗效并不突出，而且肺部炎症程度的减轻对纤维化的改善也并不明显，因此

  该理论受到了质疑。目前研究证据表明，纤维化反应是由肺泡上皮细胞重复性损伤

  造成的，认为Ⅱ型肺泡上皮细胞的功能失调是肺纤维化发病机制的关键。异常活化的

  肺泡上皮细胞产生促纤维化效应因子，如转化生长因子-β（transforminggrowthfactorβ,

  TGF-β），Wingless/Int-1等可引起间充质细胞的迁移、增殖和活化、激活上皮到间充质

  转化，又可募集成纤维细胞促使其分化，导致胶原（Collagen）和纤维连接蛋白

  （Fibronectin）等ECM成分的合成增加[14,15]。伴随着ECM成分的逐渐累积，肺部基体

  结构开始逐渐发生变化[16,17]，肺部组织结构遭到破坏，肺功能性丧失，机体因器官衰

  IPF关键的病理特征是上皮的修复异常，环境暴露对肺泡上皮的慢性损伤可能是重

  要的发病因素。由于肺和呼吸道与周围的空气是连续性接触的，导致呼吸道上皮细胞

  不断暴露于污染物、动物抗原以及病毒等外部环境。对于机体自身，肺泡也受到微吸

  入、胃食管反流和共生微生物的影响。研究发现，香烟烟雾会导致DNA甲基化，某些

  环境暴露会引起组蛋白去乙酰化酶的上调，降低抗纤维化因子的生成，某些病毒暴露

  也与IPF风险增加有关，例如，EB病毒、巨细胞病毒、人类疱疹病毒等[18,19]。而且，

  EB病毒和巨细胞病毒在IPF中载量很高，IPF患者的AECs也检测到EBV抗原的存在。

  这表明潜在的病毒感染与IPF发生之间存在相关的机制联系。然而，慢性病毒感染

  （1）肺泡上皮细胞的异常激活：肺泡由Ⅰ型肺泡上皮细胞（Type1alveolar

  胞很薄，大约厚约0.2μm，是肺内进行气体交换的主要场所，无自我更新和增殖能力

  [23,24]。长久以来，关于IPF病理机制的研究依然十分具有挑战性，IPF的上皮细胞增殖、

  凋亡、衰老且发生上皮间充质转化。ATⅡ细胞产生肺泡表面活性剂，是ATⅠ细胞的祖细

  胞，具有干细胞功能，在肺部稳态或损伤后增殖分化为ATⅠ细胞，促进ATⅠ细胞的更新

  [25]。肺泡细胞受损后，需要具备正常功能的ATⅡ细胞去做修复。因此，目前认为，

  ATⅡ细胞的损伤是IPF发病机制的关键，IPF患者中，ATⅡ细胞凋亡、衰老、分化异常

  以及更新能力受损，而且在衰老、内质网应激、线粒体功能障碍和端粒受损等内在和

  外在因素的相互作用下，ATⅡ细胞无法进行有效的损伤修复。其次，ATⅡ细胞更新能力

  受损，导致上皮间充质发生交互作用并刺激肌成纤维细胞的激活和招募，活化的肌

  成纤维细胞将诱导大量的ECM的沉积，这些物质将破坏肺泡的正常结构，扰乱体内正

  （2）成纤维细胞的活化与细胞外基质的沉积：20世纪60年代发现皮肤伤口在愈

  合时肉芽组织出现收缩。后来经研究发现，组织在修复的过程中，成纤维细胞经历了

  表型变化。肺也同其他器官一样，上皮细胞损伤发生时，通过伤口愈合进行自我修复，

  这些细胞分泌胶原蛋白并产生收缩力来闭合伤口。当肺泡发生重复性损伤时，伤口愈

  合反应连续不断发生，从而打破机体平衡和造成组织纤维化。成纤维细胞存在于人体

  多种组织，一般处于安静状态，是ECM的主要成分。目前，成纤维细胞沉积转化成

  ECM的机制尚不清楚，可能有三个原因驱使且不断维持成纤维细胞的这种活化状态：

  第一：局部组织出现纤维化导致机械应力升高。第二：AECs分泌的TGFβ及特化基质

  蛋白增加。第三：肌成纤维细胞引起ECM的过度堆积，导致基底膜破坏和上皮细胞死

  亡。在IPF患者中，异常修复的主要特点是成纤维细胞招募过度，纤维化间充质细胞和

  炎症细胞不断产生，从而刺激ECM沉积。成纤维细胞沉积转化成ECM的机制中，整

  合素起到核心作用，激活TGF-β以及Rho/ROCK信号通路促进成纤维细胞的分化。

  成纤维细胞和异常ECM之间存在正反馈，这种正反馈循环促进纤维化的发展，改变

  ECM的组成和其硬度可能在一定程度上对IPF起到缓解作用。因此，纤维化ECM既是

  （3）血管生成与血管重塑：血管新生是组织损伤后基本的修复过程，受各种因素

  影响，起主要作用的是促进或抑制血管生成的趋化因子。IPF患者中，肺内发生异常

  的血管重塑，邻近的非纤维化组织血管高度化，纤维化区域血管较少，成纤维细胞灶

  内几乎不见毛细血管，表明IPF的纤维化病灶形成过程中不需要新生血管。因此，

  一部分病理环境下，血管新生的增加似乎对纤维化起到促进作用，而在另一部分的环

  TGF-β/SMAD信号通路是IPF发病机制中涉及的关键信号通路。TGF-β对创面的生

  理性和病理性愈合都至关重要，是纤维化关键信号分子之一。TGF-β被细胞分泌激活

  后，与靶细胞上的受体结合，启动纤维化信号级联反应。当前，认为TGF-β是最有

  效且最普遍的促纤维化生长因子，在几乎全部的器官或组织纤维化中，TGF-β在蛋白

  水平或转录水平表达均升高。在调节成纤维细胞活化过程中，SMAD蛋白具有十分

  复杂的作用，可参与促进成纤维细胞活化过程，也可抑制成纤维细胞活化过程。TGF-β

  与其受体结合，磷酸化SMAD2和SMAD3复合物，使其与SMAD4结合，促进

  启动子结合，激活成纤维细胞，促进ECM的合成。SMAD2对SMAD3的促纤维化

  功能具有重要的调节作用。SMAD4既参与了TGF-β/SMAD信号通路，又参与了骨形态

  形成蛋白信号通路，不仅对SMAD2/SMAD3复合物的核移位具有促进作用，也促进

  信号通路相互作用，诱导NOX4等多种基因的表达，NOX4可诱导ROS的生成，

  进一步促进成纤维细胞的增殖、迁移、活化以及EMT过程，最终导致上皮细胞凋亡，

  ECM合成增加。另外，TGF-β也可通过降低抗氧化酶促进ROS的产生。在哺乳动物中，

  TGF-β有三种不同的亚型，TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，三种亚型在氨基酸水平上有

  70-82%的同源性。TGF-β1、2、3是三个不同基因的产物，三种异构体的形成都是细胞

  物活性。因此，需要将TGF-β从LTGF-β中释放，将其激活。LTGF-β激活的标准模式

  一般为强酸强碱或热处理等，生理过程中可由基质金属蛋白酶、纤溶酶、血栓蛋白酶

  或与整合素结合等诱导TGF-β从LTGF-β中释放。LTGF-β在体内可被ROS快速激

  活，由于ROS的激活比蛋白酶高效。因此，细胞中ROS的产生可进一步活化TGF-β，

  通常，IPF患者表现为劳力性呼吸困难（活动时呼吸困难），伴有或不伴有干咳，

  部分患者会出现指棒症，呼吸系统恶化数天至数周，常伴有发烧和流感。但该些症

  状也出现在其他疾病中，因此，为了确定诊断并排除ILD，需要临床特征、胸部影像学

  已进行多组随机对照试验，认为对机体生理功能无害，但用药过程中患者仍存在光敏

  感性、皮疹、厌食等不良反应，尤其对肝功能具有一定的损伤性[41,42]。在最初的II期

  临床试验中，尼达尼布对轻度或中度IPF患者可起到减轻的作用，但在临床给药尼

  达尼布的过程中患者也常出现腹泻、体重减轻、肝毒性和潜在出血等不良反应，对于

  冠状疾病和心肌缺血患者，用药过程要防止动脉粥样硬化和心肌梗死的[44,45]。但综合

  而言，尼达尼布在临床实验具有普遍的良好的耐受性。与吡非尼酮类似，患者在用药

  过程中要定时对肝功能进行检测。由于特发性肺纤维化是一种慢性的、不可避免的

  克隆抗体，在二期临床实验研究中对肺功能，高分辨率CT和生活质量各项进行评估，

  均达到了统计学意义，目前正在进行3期国际多中心临床实验。PBI-4050（3-戊基苯

  乙酸钠盐）可抑制成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，减少促炎和促纤维化介质的表达

  酶），GS-6624（人源性LOXL2单克隆抗体），来瑞组单抗等药物都在2期临床

  试验中。当前，肺移植仍然是目前临床上治疗IPF的最有效的方式。尽管IPF患者肺移

  植后的5年生存率约为44%[53]，但是肺移植仍是晚期IPF患者延续生命的唯一方法[54,55]。

  IPF患者通常在病程的晚期转诊，许多患者在接受移植前死亡。因此，在初步诊断时就

  面活性剂（pulmonarysurfactant,PS）的脂蛋白混合物的主要来源。PS主要由脂质和蛋

  白质组成，其中80%的脂质是磷脂，磷脂成分中，磷脂酰胆碱含50-60%，其余的包括

  磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺等。蛋白主要由两种极性疏水表面活性剂

  蛋白SP-B和SP-C组成。PS覆盖肺泡间隙，可极大地降低肺泡表面张力，使肺部能

  够在正常的压力下进行呼吸。在一些家族性IPF病例中，已发现SP-C和SP-A突变，

  这可能导致蛋白质错误折叠、蛋白质聚集、内质网应激、ATⅡ细胞损伤以及肺泡表面

  张力增加，导致肺泡塌陷。之前已有报道，大多脂质来源的介质可作为第二信使调

  节细胞迁移、增殖、凋亡、氧化还原和细胞骨架等功能。脂质介质的生成异常和多

  种疾病的生理和病理过程相关，包括癌症、脑损伤、心血管、肾脏和肺部并发症等。

  棕榈酸和其他长链饱和脂肪酸的合成对于甘油三酯、磷脂和鞘脂的生成至关重要，这

  些脂肪酸分子物种决定了它们的功能和代谢命运，IPF患者的肺部检测到棕榈酸水平升

  高，但组织中游离脂肪酸的水平降低。IPF是一种病因不明的进行性肺部疾病，其

  特征为远端肺结构扭曲、炎症和纤维化。IPF病理生理的分子机制尚不完全清楚。无论

  所涉及何种细胞类型，基因表达的改变、糖酵解的中断、线粒体氧化、蛋白质折叠的

  失调以及磷脂和鞘脂代谢的改变都会导致肌成纤维细胞的激活、ECM蛋白的沉积、肺

  部结构的重塑和组织纤维化。因此，磷脂、鞘脂和多不饱和脂肪酸的脂质介质在肺

  PC)的切割。lysoPC通过溶血磷脂酰基转移酶转化为PC，也可被溶血磷脂酶A1、溶血

  磷脂酶C和溶血磷脂酶D（Autotaxin,ATX）降解。ATX具有溶血磷脂酶D的活性，可

  皮肤疾病高度相关的物质。内皮脂肪酶（endothelialipase,EL）和肝脂肪酶

  胆碱（lysoPC18:1）、亚油酰-溶血磷脂酰胆碱（lysoPC18:2）、花生四烯酰-溶血磷脂酰

  GPR4的配体，对G2A的亲和力明显高于GPR4[69]。G2A在淋巴细胞和巨噬细胞上高表

  达，该缺失会导致T细胞的过度增殖，诱发晚期自身免疫性疾病，lysoPC通过与

  G2A受体结合，激活丝裂原活化蛋白激酶，可诱导T淋巴细胞发生迁移[71,72]。LysoPC

  子的产生，调节炎症和感染性疾病。因其结构和来源不同（如图1-2显示不同结构的

  [76]、增加巨噬细胞的趋化性和细胞吞噬功能。因此，在动脉粥样硬化的早期发病过程

  脂质介质，抑制饱和lysoPC引起的炎症反应，减少血浆渗漏和炎症细胞激活，抑制炎

  症介质的产生。LysoPC16:0也可刺激胰岛素的分泌影响糖尿病的发病进程。肝

  内胆管癌、卵巢癌和结直肠癌患者中lysoPC16:0表达水平较低。LysoPC18:0在细菌

  且，lysoPC18:0水平与乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌发病率呈现负线是用于诊断肾上腺脑白质营养不良的标志物。在婴儿期，lysoPC14:0与

  机体的快速生长显著相关，可用于预测肥胖。总之，lysoPC在多种生物学疾病的发

  我们研究发现，在IPF患者血清样本中，lysoPC14:0和lysoPC16:0表达丰度升高，

  且lysoPC14:0高于lysoPC16:0。使用博来霉素损伤A549细胞，取其培养基上清进行高

  效液相质谱分析，与对照组相比，培养基上清中lysoPC14:0表达水平明显上调。由于

  脂质代谢在生物学过程中发挥着重要的功能作用，各种不同类型的脂质也在肺纤维化

  中被广泛研究，如鞘脂，溶血磷脂酸等[65,86]。异常活化的肺泡上皮细胞分泌不同的介

  质，对上皮间充质产生影响。鉴于肺纤维化的病因可能是由于上皮细胞和成纤维细胞

  的交互作用，因此，在体外主要探究lysoPC14:0对肺成纤维细胞的作用影响，在体内

  （1）体内实验：口咽插管向小鼠肺内灌注lysoPC14:0，剂量为50μg/只，灌注体

  积50μL，为评估lysoPC对小鼠纤维化严重程度的影响，设置博来霉素为阳性对照组，

  同等体积灌注剂量1.1U/kg，Tween-20为阴性对照组，同等体积灌注50μg/只。体内灌

  注14天后，解剖小鼠取材。HYP作为细胞外基质胶原的主要成分，是测定肺纤维化严

  重程度的金标准。因此，取小鼠肺右下叶进行羟脯氨酸含量测定以及检测小鼠肺内

  化，刺激成纤维细胞的活化，导致ECM沉积，TGF-β可依赖于经典激活通路TGF-

  β/SMAD信号途径在纤维化的发生过程中起作用。在调节成纤维细胞活化过程中，

  SMAD蛋白的作用十分复杂，既可促进成纤维细胞活化，又也可抑制成纤维细胞活化。

  因此，对小鼠肺中SMAD相关蛋白进行检测，以此来评估lysoPC14:0灌注小鼠后TGF-

  （2）体外实验：由于异常的上皮损伤使得肺泡表面活性物质分泌异常，lysoPC分

  泌增加，打破肺内正常的微环境将。因此LysoPC14:0作为上皮分泌过多的一种介质，

  成纤维细胞作为肺纤维化发病过程中的效应细胞，鉴于上皮与成纤维细胞的交互作用，

  因此，主要探究lysoPC14:0对成纤维细胞的影响。首先，探究lysoPC14:0对成纤维细

  胞上的增殖、迁移以及活化作用。实验结果得出，lysoPC14:0对成纤维细胞的增殖和活

  化具有一定的促进作用。因此，探究了lysoPC14:0对成纤维细胞活化的机制，发现

  18:0和22:0等长链脂肪酸结构可诱导氧化应激，但lysoPC14:0并不具备该功能。然

  lysoPC14:0处理过成纤维细胞后，发现细胞内ROS以及线粒体ROS的生成升高。对成

  纤维细胞使用ROS的抑制剂后，发现Collagen1的生成减少，p-SMAD3表达降低。所

  以，认为lysoPC14:0激活TGF-β/SMAD信号通路是通过ROS信号通路起作用。进一步

  探究了lysoPC14:0是如何增加ROS的生成，由于肺部在异常的缺氧环境下，主要利用

  脂肪酸分解提供能量，因此，当其抑制了脂肪酸的β氧化后，发现lysoPC14:0对成纤

  维细胞的活化作用减弱且p-SMAD2的表达降低。因此初步得出结论，lysoPC14:0刺

  IPF是一种发病机制未明、与年龄相关的、慢性的、进行性且致死率极高的肺部疾

  病，每年导致数百万人死亡，严重危害人类健康。IPF的特征是上皮细胞异常激活、成

  纤维细胞活化、间质中ECM蛋白沉积增加且形成蜂窝状病灶，导致肺部功能丧失，

  患者可因呼吸衰竭而引起死亡。长期以来，该病被认为是由炎症引起的，但目前大

  量证据说明，纤维化反应主要是由异常活化的肺泡上皮细胞驱动，这些细胞产生各种

  维化的发生发展中起关键作用。一方面，甘油磷脂在酶的催化下可生成磷脂酰胆碱，

  磷脂酶分解磷脂酰胆碱产生饱和lysoPC，另一方面，EL和HL裂解HDL-PC生成不饱

  和lysoPC。LysoPC主要通过GPCRS和Toll样受体在生物学过程中行使其功能，可促

  进免疫细胞的迁移，诱导促炎因子的产生，促进氧化应激，从而导致疾病的发生。

  由于脂肪酸链的长度不同，将12C以下的称为短链脂肪酸，12C-22C之间的称为长

  链脂肪酸，大于22C的称为超长链脂肪酸。根据是否所含双键以及双键在数目上的差

  别，又将其分为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸。根据来源和结构的不同，lysoPC在不

  同疾病的发生过程中发挥着不同的作用。LysoPC16:0是目前研究较多的，可刺激糖尿

  病患者体内胰岛素的分泌，还可通过促进炎症的发生发展，在动脉粥样硬化的发病进

  程中起重要作用。多不饱和酰基lysoPC不但能够减少血浆渗漏，而且可以抑制炎症

  细胞的激活和促炎介质的产生。由此可见，lysoPC在炎症性疾病的发展过程中起着不

  同的作用。我们研究之后发现，lysoPC14:0和lysoPC16:0在IPF患者血清样本中相对表达丰

  度升高，且lysoPC14:0关于肺部疾病相关研究较少，因此，在体外，使用lysoPC14:0

  处理成纤维细胞来探究其对成纤维细胞的增殖，迁移与活化等细胞功能的影响，进而

  （1）配制100mL的MEM完全培养基：吸取10mL的FBS，青霉素-链霉素混合液

  1mL，MEM基础培养基89mL置于经高压灭菌过且带有刻度的Lab45细胞培养瓶，

  （2）1M的NaOH溶液的配制：称取2g的NaOH将其溶于50mL经高压灭菌的双

  （3）1×PBS缓冲液：按照说明书（索莱宝，货号：P1003）的配制方法，每包PBS

  （5）10×湿转缓冲液：Tris和甘氨酸粉末分别称取30.28g、144.14g，加入适量DDW

  （6）1×湿转缓冲液：DDW稀释10×湿转缓冲液，加入20%的甲醇，放置4℃储存

  本实验采用的成纤维细胞MRC-5细胞株购自ATCC®，细胞培养使用的完全培养基

  为MEM完全培养基，1×PBS于北京索莱宝技术服务有限公司购买而来，细胞培养于

  25cm2的培养瓶或100cm2的培养皿中，置于细胞培养箱内，培养条件为：37℃，5%

  CO且培养箱内保持一定的湿度，待细胞生长密度达到70%-80%以上，进行细胞传代

  将MRC-5细胞接种于六孔板中，接种密度为1.5×10，细胞培养24h。

  （2）收集：每孔加入90μLRIRA裂解液（需加入PMSF抑制剂），使用细胞刮板沿

  孔壁边缘向内刮，确保每一处细胞都被刮到，将其收集在1.5mL的离心管中；

  （6）收集蛋白：离心过后，小心吸取细胞裂解液上清，避免抽入底部等不溶的脂质

  （8）若要进行SDS凝胶电泳，将煮好的样品插入冰上，放置10-20min即可

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